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发布日期:2024/5/20 18:11:00
细胞凋亡:正常活细胞的磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine, PS)只分布在质膜磷脂双分子层的内侧。当细胞开始发生早期凋亡时,细胞膜脂质的不对称性消失,导致PS自质膜内层翻转至外层,从而暴露在细胞表面Annexin V是一 种36 kDa的钙依赖性的磷脂结合蛋白,对PS有高度的亲和性。因此,荧光标记的Annexin V可用于检测暴露于早 期凋亡细胞表面的PS。

       当细胞处于中晚期凋亡或发生坏死时,由于细胞膜的破裂,Annexin V可以进入细胞内部与质膜上的PS结合。因此,为了区分活细胞、早期凋亡细胞和中晚期凋亡细胞(或坏死细胞),可通过将荧光标记Annexin V与核酸染料PI联合使用:活细胞和早期凋亡细胞的细胞膜仍然完整,核酸染料无法进入细胞内部与核酸结合,而中晚期凋亡细胞(或坏死细胞)由于细胞膜的破裂,核酸染料可进入细胞内部而核酸结合,通过流式细胞术检测细胞中Annexin V和核酸染料的荧光强度,可区分活细胞(Annexin V-/PI-)、早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)与晚期凋亡细胞(Annexin V+/PI+)、死细胞(Annexin V-/PI+) 

细胞周期:碘化丙啶(Propidium,简称 PI)是一种双链 DNA 的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光,并且荧光强度和双链 DNA的含量成正比。细胞内的 DNA 被碘化丙啶染色后,可以用流式细胞仪对细胞进行 DNA 含量测定,然后根据 DNA 含量的分布情况, 可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。

     碘化丙啶染色后,假设 G0/G1 期细胞的荧光强度 为 1,那么含有双份基因组 DNA 的 G2/M 期细胞的荧光强度的理论值为 2,正在进行 DNA 复制的 S 期细胞的荧光强度 为 1-2 之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生 DNA 片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组 DNA 片断在染 色过程中丢失,因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染,即荧光强度小于 1,在流式检测的荧光图上出现所谓 的 sub-G1 峰,即凋亡细胞峰。细胞发生凋亡时,由于胞浆和染色质浓缩、核碎裂,产生凋亡小体,使细胞的光散射 性质发生变化。在细胞凋亡的早期,细胞对前向角光散射的能力显著降低,对侧向光散射的能力增加或没有变化。在 细胞凋亡的晚期,前向和侧向光散射的信号均降低。因此可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察细胞凋亡情况。   

活性氧ROS:活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)是指生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称。活性氧(ROS)的流式检测通常是通过使用荧光探针如DCFH-DA来监测细胞内活性氧水平的变化。细胞内活性氧的升高是细胞凋亡的标志之一。

       活性氧检测试剂盒 (Reactive Oxygen Species Assay Kit,也称ROS Assay Kit) 是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测,全称为2,7-二氯荧光素二乙酸酯。DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。     

EdU检测法:中文名为5-乙炔基-2' -脱氧尿苷,是一种新型胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷,thymidine)类似物,它可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中,基于EdU与染料的共轭反应可以进行高效快速的细胞增殖检测分析。    

优势:与传统的BrdU相比,传统的BrdU有一大缺点,就是需要变性DNA后才能与抗体结合,但这就破坏了DNA双链结构,影响了其他染料的结合染色,导致染色弥散,准确性降低等问题。而EdU检测法更简单、更快速、更准确,单个细胞也能准确检测,具有更高的灵敏度和更快的检测速度。    

 钙离子荧光探针:是一种细胞膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料,钙离子荧光探针系列本身无荧光,当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光,钙离子荧光探针系列进入细胞,细胞内荧光强度增加,即膜电位增加表示细胞去极化;反之,细胞内荧光强度降低即膜电位降低表示细胞超极化。钙离子荧光探针系列是目前常用的线粒体膜电位检测荧光探针。 

JC-1:是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时,JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体(monomer),可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。   

      线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件,通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降,同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。 
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